我們可以從已知最小的脊椎動物大腦中學到什么？是越大越好嗎？有時，結(jié)構(gòu)較大時更容易看到。但是，就新發(fā)現(xiàn)的Danionella而言，打開了一扇新的大門，透過它我們可以實時觀察正在工作和發(fā)育的大腦，進一步了解如何將新技術(shù)應(yīng)用于這個快速發(fā)展的行為神經(jīng)科學領(lǐng)域。

追蹤已知最小脊椎動物大腦的微小透明魚
Danionella是小型淡水鯉科魚類的一個屬，在緬甸的山區(qū)發(fā)現(xiàn)了該屬的一個新物種：Danionella cerebrum。這種魚因其擁有目前已知最小的成年脊椎動物大腦而得名（cerebrum：拉丁語中的“大腦"）。Danionella cerebrum具有光學半透明性、豐富的行為特征和僅0.6 mm ³的腦體積，在成年脊椎動物中具有更高認知功能的單細胞分辨率的全腦體內(nèi)成像分析中具有巨大的前景。

這種新的Danionella以前被誤認為是Danionella translucida，因為這兩個物種具有很大的外部相似性，因此很難識別分類學差異。 然而，對Danionella translucida和Danionella cerebrum進行的比較形態(tài)學和分子分類學分析揭示了一些差異，例如骨骼特征，并清楚地表明這是兩個不同的物種，根據(jù)分子分析，它們在大約 1300 萬年前彼此分離^[1]。

圖片來源：Ralf Britz 博士，森肯伯格自然研究學會

觀察魚的大腦
Danionella的不同物種目前開始成為行為神經(jīng)科學的重要神經(jīng)生理學模式動物。由于這些魚的尺寸微小、解剖結(jié)構(gòu)簡單以及光學半透明性，因此可以在細胞層面上研究這些魚的大腦功能。

Danionella cerebrum的演化也與斑馬魚密切相關(guān)，斑馬魚是行為神經(jīng)科學領(lǐng)域成熟的模型，與Danionella cerebrum一樣，都表現(xiàn)出豐富的行為。

Nina Lindemann等人最近的一項研究^[2]旨在在明暗測試中比較Danionella cerebrum和斑馬魚的幼魚運動活動，測量驚嚇反應(yīng)和其他行為。

魚類視頻追蹤：動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)遇見Danionella
Lindemann 等人使用由Noldus定制的觀察箱（由動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)供電和控制）來確定Danionella cerebrum和斑馬魚幼魚之間的行為差異。實驗裝置由諾達思制造的尺寸為 666 毫米（長）× 472 毫米（寬）× 1010 毫米（高）的定制黑箱組成，可保護幼魚免受外部影響。該盒子通過位于底部的白光和紅外的背光進行照明，并包含一個鏡頭，頂部還帶有 850 nm紅外濾鏡。白光裝置連接到諾達思的USB-IO 盒，該盒連接動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)進行控制。

動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)是應(yīng)用于跟蹤和分析任何動物的行為、運動和活動研究中的視頻跟蹤軟件。在研究魚類或昆蟲時，還可以結(jié)合兩個攝像機角度對實驗對象進行跟蹤，并結(jié)合三維軌跡跟蹤系統(tǒng)中的三維跟蹤項目實現(xiàn)三維追蹤。


趨觸性
透過在 12 孔板的每個孔內(nèi)定義外部和內(nèi)部區(qū)域（具有相等的表面積）來評估明暗測試中的趨觸性，其中在 80 分鐘內(nèi)，打開和關(guān)閉燈各兩次。明暗狀態(tài)之間的切換和計時是使用諾達思的USB-IO盒控制的，該盒與研究人員的定制化設(shè)定和動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)整合。

在測量了 4.2 毫米的平均幼魚體長后，作者將運動閾值設(shè)定在0.42至0.84毫米/秒之間（3 幀的平均值：100毫秒），以區(qū)分運動和不運動的幼魚。這意味著，當幼魚每秒移動的距離小于其身體長度的1/10時，它們被視為不移動，而當它們每秒移動的長度超過其身體長度的1/5時，則被視為移動。

斑馬魚的運動活動有何不同？
乍一看，4-6 dpf Danionella cerebrum和斑馬魚的幼魚運動活動似乎非常相似。例如，兩個物種在黑暗階段（與光明階段相比）的休息時間減少和速度增加相似。此外，在 4 dpf 時，與5 dpf和6 dpf幼魚相比，這兩個物種對光照變化的驚嚇反應(yīng)不同且不太明顯。此外，在4 dpf時，Danionella cerebrum（而非斑馬魚）偶爾會表現(xiàn)出類似「Rosetta」的同心軌跡運動模式，然而，在斑馬魚幼魚中并沒有觀察到這種活動模式。

光照和黑暗中的趨觸性
與斑馬魚相比，Danionella在光照期間表現(xiàn)出更強的觸動性，并且在從暗到亮的過渡期間表現(xiàn)出強烈的驚嚇反應(yīng)。也發(fā)現(xiàn)Danionella更喜歡占據(jù)水體的下部區(qū)域^[3]。所有這些都表明該物種偏好黑暗環(huán)境。

焦慮樣行為與環(huán)境
趨觸性與焦慮樣行為有關(guān)。 Lindemann等人認為，盡管Danionella在光下表現(xiàn)出比斑馬魚更強的觸動性，但并不認為會增加它們的焦慮水平。相反，作者更傾向于基于環(huán)境的假設(shè)作為可能的解釋。

基于Danionella和斑馬魚不同的自然棲息地，這似乎是合理的，這可能是這兩個物種之間不同驚嚇反應(yīng)的基礎(chǔ)。斑馬魚幼魚對明暗開關(guān)反應(yīng)強烈，對暗光開關(guān)反應(yīng)較弱。而Danionella則相反：對暗-亮開關(guān)反應(yīng)強烈，對明-暗開關(guān)反應(yīng)較弱。


斑馬魚更喜歡生活在靠近水面的地方
Danionella和斑馬魚生活在不同深度的水體。Danionella生活在水面下30厘米的深度，而斑馬魚通常在靠近水面淺而清澈的水中產(chǎn)卵^{[1, 3]}。實際上，在實驗室環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)80% 的Danionella占據(jù)了水箱的下部區(qū)域（0-12 厘米），而斑馬魚主要( 80%) 占據(jù)了水箱的上部區(qū)域（24-36 厘米）^[4]。

這可以解釋斑馬魚幼魚的典型驚嚇反應(yīng)，斑馬魚幼魚在暗光轉(zhuǎn)換中較弱，因為它們可能更習慣于較亮的環(huán)境。

魚類體內(nèi)腦部造影
Danionella和斑馬魚都非常適合在幼魚階段進行全腦（體內(nèi)）腦部造影。 Lindemann等人在研究中發(fā)現(xiàn)的表型行為差異（光-暗和暗-光反應(yīng)）為研究這兩個相關(guān)物種之間的神經(jīng)生理機制以及可能的神經(jīng)回路進化提供了機會。事實上，它們的反應(yīng)不同，而環(huán)境刺激卻相似。

行為神經(jīng)科學模型正在進步
隨著科技的進步，我們能夠從這樣的小動物模型中收集的信息量不斷增加，最終推動了行為神經(jīng)科學的界限。一般來說，魚在這一領(lǐng)域和其他領(lǐng)域越來越受歡迎，因為它證明了魚可以取代經(jīng)典動物試驗來治療各種疾病，如癌癥、心血管疾病、糖尿病和其他慢性或神經(jīng)系統(tǒng)疾病。從這個角度來看，減少、替代和優(yōu)化實驗室動物使用的3Rs原則開始發(fā)揮作用，進一步激勵技術(shù)進步和方案替代。

參考文獻
1.Britz, Ralf; Conway, Kevin W.; Rüber, Lukas (2021). The emerging vertebrate model species for neurophysiological studies is Danionella cerebrum, new species (Teleostei: Cyprinidae). Sci. Reports 2021 111, 11 (1), 1–11.
2.Lindemann, Nina; Kalix, Leon; Possiel, Jasmin; Stasch, Richard; Kusian, Tamia; K?ster, Reinhard Wolfgang; von Trotha, Jakob William (2022). A comparative analysis of Danionella cerebrum and zebrafish (Danio rerio) larval locomotor activity in a light-dark test. Front. Behav. Neurosci., 16, 302.
3.Parichy, D.M. (2015) Advancing biology through a deeper understanding of zebrafish ecology and evolution. eLife, 4.
4.Rajan, G.; Lafaye, J.; Faini, G.; Carbo-Tano, M.; Duroure, K.; Tanese, D.; Panier, T.; Candelier, R.; Henninger, J.; Britz, R.; Judkewitz, B.; Gebhardt, C.; Emiliani, V.; Debregeas, G.; Wyart, C.; Del Bene, F. (2022). Evolutionary divergence of locomotion in two related vertebrate species. Cell Rep.38:110585.

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